多色流式超全攻略：配色技巧及常用配色方案
图 2 PerCP 也可被 405 nm 激光激发 (虚线为激发光谱，实线为发射光谱)
04
根据抗原的表达量选择合适的荧光偶联抗体，使染料的亮度与抗原密度相匹配。
一般原则是高表达抗原与弱荧光染料配对，亮荧光染料与低表达抗原配对（强配弱，弱配强）。
当两种分子共表达于同一细胞，强表达抗原选择对其他通道影响小的荧光染料，弱表达抗原选择受影响小的通道。
如果检测生物样品中浓度未知的抗原或重要分子，则优先挑选强荧光染料。
(荧光染料相对亮度表) 根据文献查看抗原表达强弱，亮度大小参考染色指数。
荧光染料的被检测到的强度除了与其本身性质有关，还因仪器的激发光波长、检测器范围和分辨率有所不同。
05
尽量避免复合染料带来的假阳性。Donor 通道有发射峰，对 Donor 通道有补偿。Acceptor 如果与 Donor 连接断掉，Donor 发射光增强，对 Donor 通道有假阳性且补偿增大。Acceptor 激发波长也可以激发，造成对其他通道的补偿。例如可被 488nm 和 561nm 激发的复合染料 PE-Cy5.5 亦可被 640nm 激发，干扰 APC 通道，因为 Cy5.5 的激发波长与 APC 的激发波长相近。
图 3 Cy5.5 被 640 nm 激发后对 APC 所在的 670/14 通道产生干扰
06
尽量用红色荧光激发自发荧光高的样本。每种细胞群都有不同水平的自发荧光，自发荧光强度在波长较长时迅速降低。对于自发荧光较强的细胞，选择红光激发，发射波长较长的荧光素（如 APC）。
多色流式必备四大工具
Bio-Techne® 旗下的子品牌 R&D Systems™ 及 Novus Biologicals™，在提供多达 22000+种流式抗体的同时，精心设计了多款流式研究必备工具：
细胞标志物查询
Novus 光谱查看器
以交互式的方式查看荧光染色剂的激发和发射光谱
Novus 多色流式配色工具
只需简单的三个步骤，就可以为实验找到合适的产品
常用荧光染料相对亮度表
Key: 'Y-G'= Yellow-Green
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常用配色方案：免疫细胞/干细胞
流式细胞术的免疫细胞表型鉴定是非常热门的应用之一，检测表面或者胞内标志物能够对 T 细胞、B 细胞、NK 细胞、M1 巨噬细胞、M2 巨噬细胞、DC、单核细胞等进行分群。
表 1：常见的免疫细胞流式分析 Marker：
免疫细胞
流式分析指标
Rat/Mouse/HumanTreg cell
FoxP3、CD25/IL-2 Rα、CD4
MouseTh1 cell
CD4、IL-12 Rβ2、IFN-γ、T-bet
HumanTh1 cell
TIM-3、CD4、IL-12 Rβ2、IFN-γ、T-bet
MouseTh2 cell
STAT6、IL-5、IL-4 R、CD4
HumanTh2 cell
CD4、IL-10、CCR3、GATA-3、Phospho-STAT6
Human Th17 cell
CD4、IL-17A、RORα、RORγt、CXCR6
Human Myeloid DC
BDCA-3/CD141、BDCA-1/CD1c、CD11c-CFS、CD16/Fcγ RIII
HumanNK cell
CD3、NCAM1/CD56、NKp30/NCR3、NKG2D/CD314、NKp46/NCR1、Fc Gamma R III (CD16)
Intracellular NK Cell Activation
CD3、NCAM1/CD56、Granzyme B、Granzyme K、Perforin-1、Fc Gamma R III (CD16)
Human Monocyte and Dendritic Cell
HLA-DR、CD86、CD11c、CD123、CD16、CD20、CD3、CD56、CD14
HumanM1 Macrophage
CD38、CD11c、HLA-DR、CD86、NCAM1/CD56、CD20、CD3
Human M2 Macrophage
VEGF、SR-AI/MSR/CD204、CD163、MMR/CD206、NCAM-1/CD56、CD20、CD3
Human CD19 B cell
CD3、CD19、CD45
Human TBNK cell
CD3、CD4、CD8、CD19、CD56
HumanTBMNK cell
CD3、CD4、CD8、CD19、CD56、CD16、CD14
Marker
Clone
Fluorochrome
Catalog #
CD3
UCHT1*
Alexa Fluor®405
FAB100V
CD4
11830
FITC
FAB3791F
CD8
37006
APC
FAB1509A
CD19
4G7-2E3
PE
FAB4867P
CD56
2524C
Alexa Fluor®700
FAB24086N
CD16
245536
PerCP
FAB2546C
CD14
134620
Alexa Fluor®750
FAB3832S
* 标记的克隆经过HLDA的独立验证
图 4 多色流式细胞仪组合抗体识别人 T 细胞、B 细胞、NK 细胞和单核细胞亚群。PBMCs 用抗人 CD3 Alexa Fluor®405、CD4 FITC、CD8 APC、CD56 Alexa Fluor 700、CD19 PE、CD14 Alexa Fluor 750 和 CD16 PerCP 染色，所有抗体均经流式细胞术验证。经典单核细胞定义为 CD14+，非经典单核细胞定义为 CD16+；CD4 T 细胞定义为 CD3+、CD4+；CD8 T 细胞是 CD3+、CD8+；B 细胞是 CD3-、CD19+；NK 细胞是 CD3-、CD56+。
干细胞流式鉴定
● ES/iPSC 在扩增和分化之前进行多能性的确认是后续实验进展和数据分析所必需的。如果使用的细胞不是最佳状态且未经过验证，会使后续实验充满不确定性，从而浪费时间和试剂。R&D Systems™ 提供了多种 ES/iPSC 鉴定试剂盒，其中包括流式表型鉴定，能够验证 ES/iPS 细胞的多能干性。
图5 第三天小鼠胚胎干细胞使用 H/M PSC Multi-Color Flow Cytometry Kit（FMC001）进行染色。
流式鉴定试剂盒
主要产品
货号
H/M Pluripotent Stem Cells(人/鼠多能干细胞)
SOX2-PE Mouse IgG2A; Clone 245610
FMC001
Oct-3/4-APC Rat IgG2B; Clone 240408
SSEA-4-CFS Mouse IgG3; Clone MC-813-70
SSEA-1-PerCP Mouse IgM; Clone MC-480
● 研究人员利用不同的技术来分离、培养和分化造血祖细胞。实验方法的差异以及起始细胞群的差异，会造成在干细胞领域发表的文章中存在各种相互矛盾的数据和实验差异。R&D Systems™ 的 Human Hematopoietic Progenitor Cell Multi-Color Flow Cytometry Kit 能够增强实验一致性，清晰定义起始细胞群。
图 6 利用多色流式细胞术鉴定人脐带来源的造血祖细胞。利用 Human Hematopoietic Progenitor Cell 4-Color Flow Kit（货号FMC019）中提供的试剂对人脐带血细胞进行染色。对 CD11b 阴性细胞和 CD38 阴性/低的细胞（A 图中的方框区域）进行设门，并评估 CD34 和 SCF R/CD117 的阳性表达（B 图中的右上象限）。基于同型对照设定各个象限。
流式鉴定试剂盒
主要产品
货号
Hematopoietic Stem Cells(人造血干细胞)
CD34-APC Mouse IgG1; Clone QBEnd10
FMC019
SCF R/CD117-PE Mouse IgG1; Clone 47233
CD38-PerCP Mouse IgG2A; Clone 240742
CD11b-CFS Mouse IgG2B; Clone 238446
● MSC 多色流式细胞分析试剂盒
☑方便：同时检测多个公认的阳性及阴性多能标记物
☑灵活：人和小鼠 MSC 的验证均有提供
☑合规：依据国际细胞治疗协会（ISCT）的推荐来定义人 MSC
图 7 利用 Human Mesenchymal Stem Cell Marker Verification Flow Kit（货号 FMC020）中提供的抗体和试剂对人骨髓来源的 MSC 进行鉴定。数据显示了 MSC 相关的表面抗原 CD73、CD105、CD90 的阳性表达。相比之下，Negative Marker Cocktail 所识别抗原的表达极少被检测到。
流式鉴定试剂盒
主要产品
货号
Mesenchymal Stem Cells (ISTC)（人间充质干细胞）
CD90-APC Mouse IgG2A; Clone Thy-1A1
FMC020
CD73-CFS Mouse IgG2B; Clone 606112
CD105-PerCP Mouse IgG1; Clone 166707
Negative Marker Cocktail:• CD45-PE Mouse IgG1; Clone 2D1• CD34-PE Mouse IgG1; Clone QBEnd10• CD11b-PE Mouse IgG2B; Clone 238446• CD79A-PE Mouse IgG1; Clone 706931• HLA-DR-PE Mouse IgG1; Clone L203
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